阿基米德粒子檢測(cè)系統(tǒng) Archimedes Particle Metrology System
-------------以不可思議的精度重新定義粒子/細(xì)胞質(zhì)量和分析
美***麻省理工學(xué)院(MIT)的世界頂***傳感器大師Scott Manalis教授開創(chuàng)性的微通道諧振器微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS），***次實(shí)現(xiàn)精確測(cè)量fg(10-15 g)***粒子的質(zhì)量，其驚人的測(cè)量底限比目前***好的石英微天平方法高出***百萬倍。MEMS技術(shù)成為粒子分析的***新黃金標(biāo)準(zhǔn)。
詳細(xì)說明
阿基米德為粒子分析設(shè)定了***個(gè)全新標(biāo)準(zhǔn)，它采用共振質(zhì)量檢測(cè)原理準(zhǔn)確定量粒子質(zhì)量、尺寸、體積、密度和濃度等，其極高的分辨率遠(yuǎn)超過了現(xiàn)有的粒子分析方法如動(dòng)態(tài)光散射、激光衍射和布朗運(yùn)動(dòng)跟蹤，并***次實(shí)現(xiàn)了fg***納米粒子的質(zhì)量檢測(cè)。阿基米德對(duì)每個(gè)粒子單獨(dú)檢測(cè)，無需光學(xué)部件，檢測(cè)樣品與測(cè)量信息直接關(guān)聯(lián)，測(cè)量結(jié)果更為真實(shí)可靠。阿基米德不僅可以用于顆粒的重量和大小，未來該系統(tǒng)還可與HPLC連接作為密度檢測(cè)器，可以目前檢測(cè)器所不能檢測(cè)到的化合物。
阿基米德質(zhì)量測(cè)量底限示意圖:
儀器特點(diǎn)
* 自動(dòng)檢測(cè)粒子大小質(zhì)量、尺寸、體積、密度及濃度
* 粒子檢測(cè)范圍<50 nm-5 μm
* 檢測(cè)快速，NIST標(biāo)定校準(zhǔn)
* ***小樣品消耗，低至100 μl
* 極高的分辨率，***性和重現(xiàn)性
原理：共振質(zhì)量測(cè)量
阿基米德對(duì)單個(gè)粒子及活細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，分辨率低于1飛克 (10-15 g)，遠(yuǎn)超過其它流體質(zhì)量測(cè)量方法，核心在于共振微流控通道和共振質(zhì)量測(cè)量，它采用機(jī)械共振結(jié)構(gòu)，當(dāng)粒子或細(xì)胞***個(gè)個(gè)依次通過共振器時(shí)，共振頻率因粒子重量而下降。通過檢測(cè)共振頻率的改變，***測(cè)量每個(gè)粒子的質(zhì)量及大小。
* 共振器采用微電子機(jī)械系統(tǒng)制備方法，傳感器僅100 μm大小，總質(zhì)量?jī)H數(shù)ng，如此小巧輕薄的傳感器對(duì)即使很小的加載重量也非常靈敏。
* 微通道傳感器被置于真空環(huán)境中，傳感器的振動(dòng)不會(huì)消散不必要的能量，從而達(dá)到極高的品質(zhì)因子Q，通常> 10,000，因此共振頻率檢測(cè)可達(dá)極高的準(zhǔn)確度。
* 傳感器中嵌入***個(gè)微流通道，全新的應(yīng)用流體設(shè)計(jì)可將樣品自動(dòng)送入傳感器，并精確控制流速，結(jié)合極高的Q值，使傳感器更換十分迅速，實(shí)現(xiàn)快速測(cè)量且結(jié)果準(zhǔn)確。***些生物樣本如活細(xì)胞甚至可以在生理?xiàng)l件下測(cè)量。
* 共振頻率測(cè)量十分快速且分辨率高，1 kHz 頻寬時(shí)可達(dá)到十億分之***水平。
阿基米德功能
***、粒子質(zhì)量和大小檢測(cè)
阿基米德檢測(cè)單個(gè)粒子及活細(xì)胞的重量，其核心在于微通道共振器頻率偏移與粒子物理特性間的關(guān)系，即物體的浮力重量等同于它排出液體的重量。因此粒子浮力質(zhì)量可定義為它所替代液體的質(zhì)量，浮力質(zhì)量與粒子干重相關(guān)，它隨著粒子與流體的密度偏離而增加。當(dāng)粒子通過微通道時(shí)，浮力質(zhì)量導(dǎo)致共振頻率偏移，當(dāng)粒子到達(dá)共振器頂部時(shí)共振偏移達(dá)到***大，且與粒子浮重成比例。
阿基米德微通道傳感器靈敏度常數(shù)s將共振頻率偏移與粒子浮力質(zhì)量關(guān)聯(lián)，對(duì)于每個(gè)傳感器s數(shù)值固定，反映了所測(cè)粒子范圍的簡(jiǎn)單線性關(guān)系。動(dòng)態(tài)光散射只能檢測(cè)成千上萬粒子的平均數(shù)值，而阿基米德可實(shí)現(xiàn)單個(gè)粒子測(cè)量，大量粒子的共振頻率偏移依次檢測(cè)，從而得到單個(gè)粒子重量、體積、等效球體直徑等，由此建立準(zhǔn)確的粒子群體質(zhì)量和大小分布。
二、粒子密度檢測(cè)
浮力質(zhì)量導(dǎo)致共振頻率偏移。假如粒子密度比流體密度大，粒子經(jīng)過傳感器時(shí)其總體質(zhì)量增加，共振頻率下移；假如流體密度比粒子密度大，傳感器整體質(zhì)量減小，共振頻率上移。***終如果粒子密度與流體密度等同，傳感器質(zhì)量不變，即浮力重量為零，則不會(huì)發(fā)生共振偏移。因此，可以應(yīng)用調(diào)節(jié)流體密度直到共振頻率偏移消失的方法測(cè)量粒子密度。
但上述描述顯然很繁瑣。阿基米德開辟了***個(gè)新的更為簡(jiǎn)便的方法，只需將樣品分別置于二種不同密度的流體中各檢測(cè)***次，得到每個(gè)樣品的浮力質(zhì)量均值。如下圖，多孔硅粒子分別在0.786 g/cc異丙醇和1.106g/cc氘化水中檢測(cè)。結(jié)果顯示，粒子平均浮力重量在異丙醇中比氘化水大，分別為1.67pg、1.10pg。得到浮力重量數(shù)據(jù)，阿基米德通過簡(jiǎn)單的線性外推法就能自動(dòng)計(jì)算出粒子平均密度。
三、粒子濃度及內(nèi)含物檢測(cè)
阿基米德以***真實(shí)的計(jì)數(shù)方法對(duì)每個(gè)粒子單獨(dú)檢測(cè)，通過流控技術(shù)精確監(jiān)控整個(gè)測(cè)量過程中樣品流速，可提供信息包括粒子濃度 [#/ml]、樣品消耗 [μl]、固形物含量 [parts per billion]。這些信息可廣泛應(yīng)用于
* 監(jiān)測(cè)蛋白制劑中聚集物含量
* 監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)及抗生素易感性
* 檢測(cè)藻類及其它生物燃料中的生物量
* 評(píng)估油墨中阻塞打印頭的附聚物
四、極微小差異粒子區(qū)分
阿基米德可以極好的區(qū)分不同粒子質(zhì)量或大小的極微小差異，下左圖顯示二種粒子大小僅差40nm，阿基米德對(duì)粒子群體也能準(zhǔn)確區(qū)分，且標(biāo)準(zhǔn)方差不到標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的***半，標(biāo)準(zhǔn)誤差達(dá)到單個(gè)?水平。右圖顯示三種形態(tài)分布的黃金粒子，標(biāo)定為 57 nm、79 nm、100 nm，阿基米德檢測(cè)結(jié)果為57 nm、81 nm、99 nm。DLS方法檢測(cè)卻無法分辨此三種粒子，所測(cè)粒子大小也明顯有誤。
五、混合粒子分析
阿基米德***性可達(dá)NIST 1%水平。以下四種不同標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)品混合物，阿基米德可單獨(dú)分析每個(gè)亞群，得出粒子平均大小與標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)相差僅0.1%-0.5%。此外在不同批次的傳感器和儀器之間也能體現(xiàn)極好的重現(xiàn)性。
阿基米德應(yīng)用
***、蛋白制劑檢測(cè)
蛋白療法可以緩解多種人類疾病，也可以替代非內(nèi)源產(chǎn)生的關(guān)鍵蛋白，蛋白制劑在蛋白治療中起著關(guān)鍵的運(yùn)輸作用，但是蛋白聚集會(huì)降低其療效，因此十分有必要監(jiān)測(cè)它在研發(fā)、生產(chǎn)、存儲(chǔ)及運(yùn)輸治療蛋白或其它生物藥劑過程中的聚集情況。
粒子聚集
阿基米德可以準(zhǔn)確測(cè)量粒子聚集，大小低至100nm。它不再受光學(xué)或形狀變化及阻礙光學(xué)方法的乳白光的影響。其柔和的流體控制不會(huì)擾亂微弱聚集，且可適應(yīng)粘度達(dá)50cP而無需稀釋。阿基米德傳感器非常小，皮升***體積，僅需樣本100 μl，可承受聚集濃度達(dá)5x108/ml，對(duì)于高濃度制劑無需稀釋。聚集測(cè)量通過單個(gè)粒子的檢測(cè)直接測(cè)得濃度。下圖顯示4 μl 原始樣品中亞微米IgG蛋白聚集物的大小分布，所測(cè)濃度 >300 nm粒子聚集物是 4x106/ml（左圖）。基于檢測(cè)數(shù)目龐大，其分布可以計(jì)算為組成每個(gè)聚集物的基礎(chǔ)蛋白數(shù)量。
外源物區(qū)分
阿基米德也能將外源物質(zhì)從蛋白聚集物中區(qū)分。如下圖，向下的峰由聚集引起，其密度高于懸液密度。另外可見***些向上的峰，由硅油滴引起，密度小于懸液，它們的存在減小了傳感器的總質(zhì)量，使共振頻率增加。基于這些顯著差異阿基米德可以準(zhǔn)確區(qū)分聚集物與油滴，并可作出每個(gè)群體粒子大小分布。
總而言之，阿基米德可以定量分析蛋白制劑中顯微可見物甚至亞微米物質(zhì)，它為早期聚集過程中制劑質(zhì)量和外源物含量提供了很有價(jià)值的反饋信息，且相對(duì)光學(xué)方法能提供更多的信息。
二、微生物/細(xì)胞檢測(cè)
阿基米德柔和的樣品流動(dòng),確保可以在生理狀態(tài)下,提供前所未有的活細(xì)胞檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越庫爾特技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù),獲得***精確的細(xì)胞質(zhì)量分布,監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng),以及在***寬廣的動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行全血檢測(cè).
整個(gè)細(xì)菌高分辨率的體外檢測(cè)在微生物學(xué)應(yīng)用方面有重要意義，包括研究細(xì)菌生命周期以及對(duì)環(huán)境的反應(yīng)，細(xì)菌作為模式生物探討分子進(jìn)程和信號(hào)通路，傳染病中抗體發(fā)現(xiàn)和抵抗力研究。目前常規(guī)光密度法能檢測(cè)整個(gè)培養(yǎng)體系濃度，但無法測(cè)量單個(gè)細(xì)菌及其物理性能，庫爾特計(jì)數(shù)器的體積限度無法滿足個(gè)體小的細(xì)菌檢測(cè)。
阿基米德是***個(gè)可用于單個(gè)細(xì)菌物理性能測(cè)量的儀器，且分辨率極高，同時(shí)也能定量評(píng)估整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)。阿基米德亞飛克***的質(zhì)量分辨率比普通細(xì)菌質(zhì)量的1%還小，它能實(shí)時(shí)跟蹤細(xì)菌生長(zhǎng)變化過程，監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)速率、質(zhì)量和大小分布，不同階段的過渡如指數(shù)增長(zhǎng)和平穩(wěn)期，對(duì)環(huán)境因素如溫度、營(yíng)養(yǎng)、抗菌劑的反應(yīng)。此外，阿基米德還能結(jié)合高放大率視頻直接觀察細(xì)菌形態(tài)和集體行為。它可廣泛應(yīng)用于分子通路模型研究、抗菌藥物研發(fā)、藥敏測(cè)試等。
細(xì)菌質(zhì)量檢測(cè)
下圖顯示了大腸桿菌ATCC 25922檢測(cè)結(jié)果。每個(gè)向下峰即代表單個(gè)細(xì)菌通過微通道傳感器，并引發(fā)共振頻率降低。直方圖顯示浮力質(zhì)量和大小的分布，均值分別近250fg和1.8μm。除質(zhì)量檢測(cè)外，阿基米德還整合了高放大率的視頻來揭示單個(gè)細(xì)菌進(jìn)入傳感器入口時(shí)的情形。
細(xì)菌生長(zhǎng)檢測(cè)
阿基米德可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微生物群生長(zhǎng)變化，包括質(zhì)量增長(zhǎng)和聚集運(yùn)動(dòng)等。下圖顯示E. coli 25922從穩(wěn)定期至生長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)。紅點(diǎn)表示每個(gè)細(xì)菌的浮力重量和相應(yīng)的檢測(cè)時(shí)間。直方圖顯示培養(yǎng)液細(xì)菌質(zhì)量分布及培養(yǎng)成熟度，初始培養(yǎng)45min后，細(xì)菌質(zhì)量分布寬泛，顯示凝集跡象，這很可能源于curli菌毛的生成和蛋白附屬物介導(dǎo)的細(xì)菌的粘附。凝集歷經(jīng)65min后轉(zhuǎn)變成生長(zhǎng)階段，此時(shí) E. coli 大多鞭毛驅(qū)動(dòng)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行有絲分裂約20min，質(zhì)量分布變窄，集中在230fg。
M. Godin等應(yīng)用阿基米德原理，在***個(gè)比細(xì)胞自身生長(zhǎng)周期更短的時(shí)間內(nèi)捕獲細(xì)胞，分別檢測(cè)4種不同的細(xì)胞系瞬間生長(zhǎng)速率，對(duì)于每個(gè)捕獲事件，其生長(zhǎng)速率取決于捕獲開始時(shí)的細(xì)胞浮力質(zhì)量。結(jié)果表明，越重的細(xì)胞相對(duì)質(zhì)量輕的生長(zhǎng)越快。
Using Buoyant Mass to Measure the Growth of Single Cells,M. Godin etc., NATURE METHODS, (2010)
細(xì)菌對(duì)環(huán)境的反應(yīng)
營(yíng)養(yǎng)成分影響
已處于生長(zhǎng)階段的少量E. Coli 加入新鮮Luria培養(yǎng)基。E. Coli 快速經(jīng)歷細(xì)胞周期，三小時(shí)內(nèi)其平均濃度顯著增加，呈指數(shù)增長(zhǎng)。細(xì)菌內(nèi)部參數(shù)表現(xiàn)穩(wěn)定，包括平均體積、密度和細(xì)胞分子組成等。
A.K. Bryan等研究了酵母細(xì)胞在不同試劑處理后各生長(zhǎng)周期不同階段細(xì)胞密度、體積和質(zhì)量的變化。數(shù)據(jù)分析表明細(xì)胞密度和生長(zhǎng)速率是與其生長(zhǎng)周期協(xié)調(diào)***致的。
Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast, A.K. Bryan etc., PNAS, 2010
抗體影響
初始培養(yǎng)約2.75小時(shí)后，加入100 μg/ml氨芐青霉素，約為達(dá)到抑制生長(zhǎng)***小量的10倍。4min重取樣間隔時(shí)間內(nèi)，細(xì)菌數(shù)量停止增長(zhǎng)，抗生素效應(yīng)在極短時(shí)間內(nèi)得以評(píng)估。此外，細(xì)菌總數(shù)開始下降，40min后群體完全消失。由于氨芐青霉素干擾細(xì)胞壁生長(zhǎng)有殺菌性，細(xì)菌很快破碎。這在上面直方圖中有體現(xiàn)，可以看到大量低質(zhì)量碎片。共振質(zhì)量測(cè)量也曾用于檢測(cè)抗生素抗性，基于它們對(duì)滲透休克的反應(yīng)。
溫度影響
E. coliK12分別生長(zhǎng)于20℃與36℃，虛線代表不同溫度下細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。
三、顏料和墨水檢測(cè)
顏料的理化性質(zhì)對(duì)于其在終產(chǎn)品中的性能尤為關(guān)鍵，如油漆、化妝品、噴墨油墨。目前
激光衍射廣泛用于評(píng)估顏料特性。但是顏料對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)不同的吸光值以及形狀和大小的影響，使其折射率很難精確定量，因此光散射結(jié)果存在不確定性。此外需要將初始顏料粒子從可形成不穩(wěn)定分散液的聚集物中區(qū)分開來，***般儀器很難做到，且基于光學(xué)的儀器都無法檢測(cè)不透明產(chǎn)物狀態(tài)的顏料，如油漆和油墨。
阿基米德則擅長(zhǎng)測(cè)量顏料，它不受任何光學(xué)特性變化的影響，對(duì)每個(gè)顏料粒子直接檢測(cè)，包括質(zhì)量或者等效球體的直徑，并能輕易區(qū)分原始顏料和聚集物，同樣也能評(píng)估顏料在油墨、油漆或化妝品中分散的穩(wěn)定性。
顏料粒子檢測(cè)
如下圖，分析了軍用***別的顏料和添加劑，包括樣品群體的質(zhì)量、等效球體直徑、標(biāo)準(zhǔn)差及其它統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)果突出顯示了平均直徑與D10/D90。
顏料懸液檢測(cè)
阿基米德浮力質(zhì)量也能用于檢測(cè)顏料或添加劑懸液。下圖顯示了相同的LaMnO4樣品分散于異丙醇的頻移時(shí)間圖，它記錄了因LaMnO4粒子比溶液密度大(5.5 vs 0.8 g/cc)而產(chǎn)生的向下峰以及液滴輕于異丙醇而產(chǎn)生的向上峰，其中12%為正浮力液滴，它可能源于表面活性物質(zhì)或者陷于顏料混合物中的空氣在液滴懸浮時(shí)的釋放。群體監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示它在約1小時(shí)內(nèi)分散并消失。相比之下，氧化鋯和氧化鎳樣品則不含如此多低密度的氣泡或液滴。
墨水檢測(cè)
同***類型墨水分別準(zhǔn)備4份，乙酸乙酯1000：1稀釋，檢測(cè)表明粒子大小***致約130nm。對(duì)未稀釋的原樣進(jìn)行檢測(cè)，由于濃度太高 (> 1011/ml) 導(dǎo)致無法進(jìn)行單個(gè)粒子檢測(cè)，因此設(shè)定檢測(cè)>1 μm粒子，觀察由懸液中不穩(wěn)定聚集及引發(fā)的結(jié)絮。結(jié)果顯示更大量聚集樣品中粒子濃度數(shù)量有顯著差異。更大聚集量樣品濃度與更長(zhǎng)的保質(zhì)期相關(guān)，也與樣品造成噴墨噴嘴堵塞問題相關(guān)。
滬公網(wǎng)安備31011502016460號(hào)
