基于 AI 的人胰腺癌類器官藥物篩選策略
簡 介 癌癥仍然是 21 世紀的主要死因之***，雖然腫瘤學方面取得了***新進展，但大多數癌癥患者仍缺乏持久的個性化治療方案，只能通過離體實驗評價抗癌化合物及其組合物的影響。目前患者來源的器官樣本 (PDOs) 表現出長期擴展潛力，同時也保留腫瘤組織病理學以及癌癥基因突變，可作為離體測試可行、有效的模型。但是到目前為止，類器官樣品因均質性差、操作困難、自動化方案不理想而使 PDOs 在藥物篩選應用中受到了限制。此外，器官樣本在培養基中的隨機分布，也使得類器官的成像和圖像分析變得復雜。 為克服這些挑戰，我們使用 Gri3D 平臺 (SUN bioscience) 建立了 PDOs 化合物篩選工作流程，該平臺由具有適合高通量和可重復類器官培養的微腔板組成。基于標準 96 孔微孔板，每個孔內都含有***個抗細胞粘附的水凝膠微孔。在 Gri3D 上，類器官可在微孔中位于同***成像平面且穩定生長。這極大地促進了基于圖像篩選的高內涵 3D 圖像采集和定量分析。此外，該移液口可實現自動細胞接種、培養基交換和化合物孵育等實驗操作，從而提高檢測的可重復性。 在這項研究中，我們將人胰腺癌 PDOs 暴露于***系列不同劑量的抗癌化合物中，并使用活性染料 Calcein AM ( 活染 ) 和 Ethidium Homodimer-1 ( 死染 ) 進行染色，通過高內涵共聚焦成像測試 PDOs 對藥物的反應。使用基于 AI 的方法，我們高效地檢測到每個類器官樣品，并從三個通道 ( 明場、活細胞染色和死細胞染色 ) 中提取與細胞毒性相關表型特征。***先通過 PCA 或 UMAP，將提取樣品尺寸特征 ( 超過 100 個 ) 減少到 3 個組分。然后，利用機器學習在 3D 散點圖中可視化、排序和聚類處理。數據表明，50μM Palbociclib 具有與陽性對照相似的顯著細胞毒性作用，這與傳統的活 / 死細胞分析結果***致，證明了使用 AI 驅動對藥物篩選進行可靠、公正的數析方法的可行性。
實驗室耗材和儀器 Gri3D 是***個用于高通量和可重復類器官培養的即用型平臺。基于孔內水凝膠形成的***系列超密集 U 形底微孔，使每個微腔中均能生成單個類器官，并在無固體 ECM 的懸浮培養物中生長。 我們使用配備轉盤共聚焦和 sCMOS 相機的 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內涵成像分析系統可捕獲整個類器官的 3D 結構。
方法 在 96 孔 Gri3D 500 μm 孔徑的微孔塑料板中培養標準化胰腺癌類器官，并用抗癌藥物處理其 72 小時。利用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內涵成像分析系統 (Molecular Devices ) 的透射光 (TL) 對不同時間點類器官進行連續拍攝，而后對類器官進行活 / 死測定。通過 IN Carta 圖像分析軟件進行圖像分析 ( 圖 1 )。分析中，對每孔 40 個類器官進行圖像分割，并從每個類器官中提取 50 多個指標。***后，利用 StratoMineR 數據分析軟件 (Core Life Analytics)對每個類器官相關的特征進行分析。 圖 1 類器官藥物處理工作流程示意圖。該工作流程結合了 Gri3D、高內涵成像系統以及人工智能的圖像分析軟件 (Molecular Devices )
化合物的表型效應 在 Palbociclib 暴露后，細胞死活的分析中顯示類器官的存活率隨著藥物濃度的增加而下降，而在 trametinib 處理的類器官中未觀察明顯現象 ( 圖 2B )。這種基于深度學習的 TL 圖像分析方法，可以有效地檢測到單個類器官隨時間變化的參數。此外，灰度非正態因子 (GLNN) 可作為類器官灰度值測試指標。如圖 2C 所示，這個值隨著 Palbociclib 和 Trametinib 劑量的增加而降低 ( 見圖 2C )，這些藥物會引起類器官的生長缺陷。 圖 2 抗癌化合物暴露人胰腺癌 PDOs 72 小時結果。A. TL 圖像在曝光前 ( 0 小時 ) 和曝光后 ( 72 小時 ) 以及活 / 死 (Live/Dead) 實驗后的類器官的***大投影圖像。綠色：Calcein AM，活細胞；紅色：EthD-1，死細胞。B.Ethidium homodimer-1 (EthD-1) 與 Calcein AM 強度比。C. TL 圖像的灰度非正態因子(GLNN) 變化。誤差顯示標準差。每個點代表每個類器官。單因素方差分析 Dunnett 多重比較，**P<0,01，P****<0.0001，ns：不顯著。比例尺：250μm。
通過參數降維選擇合適條件 IN Carta 數據分析軟件提取了 TL、EthD-1 和 Calcein AM 通道中每個類器官相關的數百個特征參數。為了對藥物孔和對照孔進行可視化和聚集分析，我們***先通過主要成分分析法將參數降維至三個組分，即 PCA01, PCA02 和 PCA03。然后，我們在 3D 散點圖中對藥物孔和對照孔進行可視化，其中陰性對照和陽性對照分別形成其自己的簇 ( 圖 3 )，藥物中 50 uM Palbocilib 是唯******個聚類更接近陽性對照的處理組 ( 圖 3 )，這個觀察結果與活 / 死細胞的結果分析***致 ( 圖 2 )。此外，從各藥物組 (Chebyshev ***大距離 ) 與平均陰性對照的排列中顯示，50 uM Palbociclib 排在***位，而四個陽性對照孔排名前六。從這些結果表明，50 uM Palbociclib 對人胰腺癌類器官的效應***為明顯。 圖 3 通過主要成分分析進行聚類和排序。A.、B.、C. 與原始功能有加權關聯的三個 PCA 組分。D. 三種 PCA 成分的 3D 散點圖。E. 藥物組、對照組與平均陰性對照的 Chebyshev ***大距離排序。
UMAP 為了驗證我們的分析，我們使用統***流形逼近與投影法 (UMAP) 減少特征參數的維度情況。考慮到所有特征，聚類圖也顯示了聚類接近陽性對照的 50 uM Palbociclib 處理組。為確定我們是否能夠僅用明場圖像區分表型變化，我們僅使用 TL 通道的特征進行分析，但是所得的 3D 散點圖顯示沒有明顯的聚類特征，這表明需要添加其他的特征進行聚類。 圖 4 UMAP 降維和聚類。A. 所有特征的 UMAP 組份的 3D 散點圖。B. 僅 TL 通道特征的 UMAP 組份的 3D 散點圖。
概要 Gri3D 是***個用于高通量和可重復類器官培養的平臺。 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內涵成像分析系統可捕獲高通量和高分辨率的類器官 3D 結構。 IN Carta 圖像分析軟件為每個類器官生成 mask，并測量與每個類器官相關的數百個特征參數。 StratoMineR 數據分析軟件利用人工智能對每種藥物處理進行聚類和排列分析。
(文章來源于儀器網)
