大小鼠50%縮足閾值攻略——疼痛量化的精準評估
嚙齒動物的臨床前模型對于探索病理生理機制以及尋找新型鎮痛藥物而言，具有不可估量的價值。然而嚙齒動物的疼痛評估往往充滿挑戰，它們對機械或熱刺激的反應變化，被用作衡量疼痛敏感性的行為指標。由于動物無法用語言表達自己是否感到疼痛，所以可以用縮足反應來代替對感覺的語言報告，當實驗動物感受到疼痛時，爪子會立即收縮。
十九世紀九十年代，生理學***Maximilian von Frey提出疼痛是***種獨立的觸覺特性，與觸摸、熱和冷并列，且與高閾值自由神經末梢的刺激有關，來測量機械性疼痛（針刺痛覺），是目前評估實驗鼠機械性疼痛的常用方法。 1983年Dixon使用Von Frey纖維絲提出了up–down method，1994年Chaplan SR等為了檢測嚙齒動物50%縮足閾值將此方法做了進***步的修改，up–down method是在目標力水平的5%標準差范圍內單獨校準，非常準確。目前引用up–down method文獻已達上萬篇，是機械痛閾測量的金標準。且在測量縮足閾值的出版文獻中，大約60%使用了up–down method或其修正版本。 在實驗開始之前可以先用Von Frey纖維絲對實驗動物進行預實驗，測量實驗動物縮足閾值的大致范圍，以完成實驗動物和纖維絲的篩選。盡可能選擇縮足閾值相近的實驗動物和連續編號的纖維絲以保證實驗數據的精確性。 取***系列North Coast Von Frey纖維絲（如 0.4、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0g，共9根），我們取中位數 4.0g 開始對動物腳掌中部皮膚進行刺激，纖維絲彎曲至“C”或“S”型并維持6-8s，觀察動物是否縮足并記錄；每根纖維絲測試5次，每次間隔15s，五次有三次縮足即可認為有反應 。注意區別由于身體活動引起的縮足反應； 動物無反應記為“O”，有反應（縮足或舔足）記為“X”。無反應時，給予大******力度的纖維絲刺激（即4.0g的纖維絲刺激動物腳底沒有反應時，下***步選擇6.0g的纖維絲繼續刺激），有反應時則改用小******的纖維絲刺激（即4.0g的纖維絲刺激動物腳底動物出現縮足反應，下***步選擇2.0g的纖維絲繼續刺激），反復類推； 當動物出現“OX”（第***次沒縮足反應，第二次有縮足反應）或“XO”（第***次有縮足反應，第二次沒有縮足反應） 的騎跨時，重復之前的操作步驟，再連續往后測量四次，得到***串以“O”或“X”組合的序列①，將該序列與***后***根測試絲的編號輸入動物50%縮足閾值公式，計算出動物的50%縮足閾值； 動物50%縮足閾值（g）=（10^[Xf+kδ]）/10000，其中 Xf ②為***后***根測試絲編號，如下圖所示8.0g的north coast纖維絲編號為4.93。δ為所取各根纖維絲克數取對數后的均差，這個數值和north coast纖維絲編號很相近，為了方便計算，因此δ可以近似認為是所選纖維絲編號的均差即δ＝（***大纖維絲編號-***小纖維絲編號）/（n-1），n為所選纖維絲的數量。k為根據測量獲得的“X”、“O”序列查表后獲得的系數值。 這里所說的“O”或“X”組合的序列是指從***開始測試進行記錄，出現騎跨值往后再記錄四次，即***少六位，***高九位的***個序列，低于六位的序列不予考慮。如動物在***開始就在 4.0 和 6.0 之間出現騎跨，而后幾次測試依舊反復，則其序列 為“OXOXOX”；若動物開始沒出現騎跨，而后在 8.0 和 10.0 之間出現騎跨并反復，則其序列為“OOOXOXOX”； Xf 在這里直接使用測試絲編號，但亦有文獻使用***后***根絲目標力度值（以 mg 為單位）10 倍的對數值作為 Xf 代入公式 計算，即 Xf=lg（10000f），其中 f 為纖維絲目標力度（g）。我們以此法換算出的 Xf 值與纖維絲本身編號數值很相近，因此可直接使用纖維絲編號作為 Xf 代入計算。 在0.4、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0g，共9根纖維絲，我們選擇中間的 4.0g 力度開始測試 第***輪： 選擇4.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中未發生3次及以上的縮足反應(O) 選擇6.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中未發生3次及以上的縮足反應(O) 選擇8.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中發生3次及以上的縮足反應(X) 此時發生了第***次騎跨，重復之前的測試繼續往后測四輪 第二輪： 選擇6.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中未發生3次及以上的縮足反應(O) 第三輪： 選擇8.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中發生3次及以上的縮足反應(X) 第四輪： 選擇6.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中未發生3次及以上的縮足反應(O)第五輪：選擇8.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中未發生3次及以上的縮足反應(O) 第***步 根據序列確定k值： 此序列為OOXOXOO 根據k值表可知k＝0.039 ； 第二步 根據編號算均差： 將這9根纖維絲對應的編號（3.61、4.08、4.17、4.31、4.56、4.74、4.93、5.07、5.18）取均差δ＝（5.18-3.61）/（9-1）＝0.19625； 第三步 確定Xf： ***后***根纖維絲為8.0g，可在north coast纖維絲上查看到對應的編號為4.93； 第四步 代入公式計算： 代入公式計算可以得出g＝10[4.93+0.039*0.19625]/10000＝10 0.93765 ，根據科學計算器可以得出動物50%縮足閾值（g）＝8.66g，即為動物50%縮足閾值。 若從4.0g開始，動物連續四次出現反應（即到0.4g動物仍出現縮足或舔足反應）或連續四次未出現反應（即到 15.0g 動物仍不出現縮足或舔足反應），即可直接使用 0.4g或15.0g作為動物50%縮足反應閾值； 若***開始已出現騎跨反應，但測試到***小或***大纖維絲時不足 4 次（如 XXXOXX），則繼續使用***小或***大纖維絲按照Up–Down method測量記錄，以排除假陽性或假陰性可能。 North Coast Von Frey纖維絲痛閾測試包，是用于評估皮膚觸覺靈敏度的經典工具。由20根不同規格的Von Frey纖維絲組成，單只可分為纖維絲頭、保護套和手柄三部分。測量絲的力度為0.008克-300克。Von Frey纖維絲觸覺測試不僅可應用于大、小鼠的足底，在臨床上也廣泛使用，可用于觸覺測試及高知覺和低知覺診斷。 研究機械感受受體編碼機制: 通過測定不同纖維直徑對應的感受閾值,可推斷不同種類感受受體的特性 ； 評估神經損傷后重建: 觀察纖維絲刺激感受閾值的恢復,可監測神經再生和功能修復過程 ； 研究疼痛調控機制: 使用動物模型,研究藥物或干預措施對機械性疼痛閾值的影響,有助于認識疼痛調控通路。 評估周圍神經損傷程度: 通過測定患者對纖維絲刺激的感知閾值,可判斷感覺神經功能的損害程度。這有助于診斷和監測周圍神經病變 ； 診斷糖尿病神經病變: 糖尿病患者常出現機械性感覺異常,使用纖維絲可客觀評估感覺神經功能,有助于診斷糖尿病周圍神經病變 ； 評估中樞性疼痛: 中樞性疼痛如脊髓損傷后疼痛,可使用纖維絲評估機械性感覺閾值的變化, 幫助診斷。 部分用戶名單
| 上海交通大學醫學院附屬新華醫院 | 大連醫科大學 | 中南大學湘雅醫院 |
| 中山大學附屬腫瘤醫院 | 中山大學 | 復旦大學附屬華山醫院 |
| 四川大學華西醫院 | 第四軍醫大學 | 上海市第六人民醫院 |
| 中***人民解放軍總醫院 | 浙江大學 | 武漢大學人民醫院 |
| 西京醫院 | 吉林大學 | 中日友好醫院 |
| 北京大學口腔醫院 | 中***科學院昆明動物研究所 | 天津醫科大學總醫院 |
參考文獻 1. H wang, Sung-Min et al. “Specific transcription factors Ascl1 and Lhx6 attenuate diabetic neuropathic pain by modulating spinal neuroinflammation and microglial activation in mice.” Biomedicine & pharmacotherapy =Biomedecine & pharmacotherapie vol. 173 (2024): 116392. doi:10.1016/j.biopha.2024.116392 2. Chen, Szu-Han et al. “Ultrahigh frequency transcutaneous electrical nerve stimulation for neuropathic pain alleviation and neuromodulation.”Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics, vol. 21,3 e00336. 16 Feb. 2024, doi:10.1016/j.neurot.2024.e00336 3. Rein, Ben et al. “MDMA enhances empathy-like behaviors in mice via 5-HT release in the nucleus accumbens.” Science advances vol. 10,17 (2024): eadl6554. doi:10.1126/sciadv.adl6554 4. Messina, Diego N et al.“Complex alterations in inflammatory pain and analgesic sensitivity in young and ageing female rats: involvement of ASIC3 and Nav1.8 in primary sensory neurons.” Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society ... [et al.] vol. 73,4 (2024): 669-691. doi:10.1007/s00011-024-01862-z 5. Wang, Siyuan et al. “HK2 in microglia and macrophages c
